ELISA试验的条件

1．固相载体的选择

   载体的种类很多，其中包括纤维素、交联右旋糖酐、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。从使用形式上可有凹孔平板、试管、珠粒等。

   聚苯乙烯凹孔板是应用最广泛的一种载体。聚苯乙烯塑料微量滴定板吸附蛋白的性能好，操作简便、用量小，适于大批检查。

   由于聚苯乙烯的工艺过程不够稳定,造成各批次差异较大。所以进行ELISA之前，必须进行筛选。

检查方法：

⑴ 吸附性能的检查：先加抗体包被，然后加入同一稀释度的酶标抗体，最后加底物、显色、测OD值,求出总平均OD值,再求出每相邻两孔的OD平均值,此均值在总均值的±10%以内为合格,若中间孔与四周孔OD值相差太大，或一侧与另一侧孔OD值相差较大均属不合格。

⑵ 对比测定阳性血清与阴性血清，观察是否存在明显差异，若二者OD值相差于10倍以上者为合格。

   板的处理。新板一般不用处理,用蒸馏水冲洗即可应用。板用一次即废。但不少实验工作者认为用超声波处理，清洁液Tritonx100、20%乙二醇处理仍可应用。但发现空白对照显色较深和阳性样品显色结果不理想时，应弃去不用。

2．载体的吸附条件

   载体的吸附均为物理吸附。吸附的多少取决于PH值、温度、蛋白浓度、离子强度以及吸附时间等。

   较好的吸附条件是：离子强度为0.05Mol/L～0.10Mol/L，pH9.0～pH9.6碳酸盐缓冲液，蛋白浓度为1μg/ml~100μg/ml，4℃过ye或37℃3h。

3．酶标抗体使用浓度的确定

   于聚苯乙烯板孔中加足够量的抗体包被,温育一定时间，冲洗、把酶标结合物倍比稀释，每个稀释度加2孔,温育、冲洗、再加底物显色、比色。以OD值为纵坐标,酶标结合物的稀释度为横坐标，制作曲线。找出OD值为1时，相对应的酶标抗体稀释度为最适酶标抗体稀释度。

   这个稀释度是指在这种条件下的最适稀释度，换个条件就不是最适的了。如1：400的酶标抗体稀释度温育6h可与1：6 400稀释度温育24h结果相同。所以一旦条件确定之后，就不要变更，以保证结果的重复性和相对的准确性。

   此最适酶标抗体稀释度可做为工作浓度，也可提高半个至一个滴度，但不能提高过高，否则非特异性显色增加。

   酶标抗体的滴度反映酶标抗体的质量，也可以此比较酶标结合物的优劣。有材料报道认为1：320滴度为合格,1：1 000以上更好。酶标抗体滴度越高，用于工作浓度的稀释倍数就越大，敏感性就越高，非特异性反应就越低。

4．抗原：

⑴ 抗原的要求：

   用于ELISA的抗原必须采用相当纯的抗原，如果含有其它杂质，将与抗原共同竞争固相载体上的有限位置。用于其它血清学反应的抗原不一定能适用ELISA实验，必须经过试验，抗原必须能牢固地吸附于载体上，而不丧失其免疫活性，且可得到有规律的重复的结果。另外在吸附载体后，对加入的各种试剂产生最小的非特异性吸附，即与阴、阳性血清结合差异较大。

⑵ 抗原效价的测定

   可采用单方阵或双方阵试验。①单方阵试验：以不同稀释度的抗原包被酶标板，以常规的1：200倍稀释的阳性血清加入，再加入酶标抗体、显色、测OD值，以OD值为1.0时，相应的抗原浓度作为使用效价；②双方阵试验比较精确，它既能测出抗原的最适浓度又能测出抗体的最适浓度。即将抗原抗体均稀释成不同浓度进行酶标抗体反应，以血清稀释倍数最高的阴、阳性血清的光吸收值差******的所对应的抗原稀释度为抗原的使用效价。

   已吸附的抗原的固相载体经冻干或干燥保存很稳定,数月仍不失活。

5．清洗液 一般采用0.01Mol/L pH 7.2 PBS吐温缓冲液

   吐温是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，为非离子型的表面张力物质,常做助溶剂。吐温的编号依聚合山梨醇所结合的脂肪酸种类不同而定。吐温20是结合月桂酸、吐温40是结合棕榈酸、吐温60是结合硬脂酸,吐温80是结合油酸等。通常用吐温20加入缓冲液内做为湿润剂,以减少非特异性吸附。也可在PBS缓冲液中加入1%牛血清白蛋白(或10%小牛血清或卵清蛋白),特别在抗原包被以后,以牛血清白蛋白缓冲液再包被一次,而占据孔内剩下位置,这样来减少非特异性反应。

6．反应时间

   抗原与抗体、抗体与酶标抗体反应一般在37℃ 2h～3h达到高峰。时间太短,敏感性下降,时间太长,吸附的抗原或复合物(在这个温度下)可能脱落。

7．抗体

   抗体效价的测定同抗原,采用双方阵试验。

   酶底物反应时间的确定：一般采用15min～30min～45min。也可以标准阳性血清为准,随时测定其OD值,当达到规定的OD值时,即终止反应。