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肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒说明

肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒说明
本试剂盒仅供研究使用。
检测范围:96T
20 ng/L -400 ng/L
使用目的:
肿瘤坏死因子α(TNF-α)ELISA试剂盒说明
本试剂盒用于测定细胞样本中肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量。
实验原理
本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。用纯化的
人肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次
加入肿瘤坏死因子α(TNF-α),再与HRP 标记的肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体结合,
形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB 显色。TMB 在HRP 酶的催
化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的肿瘤坏死因子
α(TNF-α)呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度(OD 值),通过标准曲线计
算样品中人肿瘤坏死因子α(TNF-α)浓度。
试剂盒组成
1 30 倍浓缩洗涤液20ml×1 瓶7 终止液6ml×1 瓶
2 酶标试剂6ml×1 瓶8 标准品(800ng/L)0.5ml×1 瓶
3 酶标包被板12 孔×8 条9 标准品稀释液1.5ml×1 瓶
4 样品稀释液6ml×1 瓶10 说明书1 份
5 显色剂A 液6ml×1 瓶11 封板膜2 张
6 显色剂B 液6ml×1/瓶12 密封袋1 个
标本要求
1.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能
马上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融
2.不能检测含NaN3 的样品,因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
操作步骤
1. 标准品的稀释:本试剂盒提供原倍标准品一支,用户可按照下列图表在小试管中进行稀
释。
400 ng/L 5 号标准品150µl 的原倍标准品加入150µl 标准品稀释液
200 ng/L 4 号标准品150µl 的5 号标准品加入150µl 标准品稀释液
100 ng/L 3 号标准品150µl 的4 号标准品加入150µl 标准品稀释液
50 ng/L 2 号标准品150µl 的3 号标准品加入150µl 标准品稀释液
25 ng/L 1 号标准品150µl 的2 号标准品加入150µl 标准品稀释液
2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、标准孔、
待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50µl,待测样品孔中先加样品稀释液40µl,
然后再加待测样品10µl(样品最终稀释度为5 倍)。加样将样品加于酶标板孔底部,尽
量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
3. 温育:用封板膜封板后置37℃温育30 分钟。
4. 配液:将30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水30 倍稀释后备用
5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30 秒后弃去,如此
重复5 次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶标试剂50µl,空白孔除外。
7. 温育:操作同3。
8. 洗涤:操作同5。
9. 显色:每孔先加入显色剂A50µl,再加入显色剂B50µl,轻轻震荡混匀,37℃避光显色
15 分钟.
10. 终止:每孔加终止液50µl,终止反应(此时蓝色立转黄色)。
11. 测定:以空白空调零,450nm 波长依序测量各孔的吸光度(OD 值)。测定应在加终止
液后15 分钟以内进行。
操作程序总结:
计算
以标准物的浓度为横坐标,OD 值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的
OD 值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD 值计算出标
准曲线的直线回归方程式,将样品的OD 值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,
即为样品的实际浓度。
注意事项
1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未
用完,板条应装入密封袋中保存。
2.浓洗涤液可能会有结晶析出,稀释时可在水浴中加温助溶,洗涤时不影响结果。
3.各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好
控制在5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
4.请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD 值
大于标准品孔第一孔的OD 值),请先用样品稀释液稀释一定倍数(n 倍)后再测定,计
算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。
5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6.底物请避光保存。
7.严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8.所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9.本试剂不同批号组分不得混用。
保存条件及有效期
1.试剂盒保存:;2-8℃。
2.有效期:6 个月
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