商品属性:
产品名称 |
规格 |
保存条件 |
货号 |
Stbl4电转感受态细胞 |
5×50 μl/20×50 μl/10 μl |
-80℃(6个月) |
EY-01G98564 |
Stbl4菌株来源于 Stbl2 E. coli strain,可用于慢病毒载体或逆转录病毒载体的构建。Stbl4菌株适合克隆不稳定插入片段 (正向重复序列,逆转录病毒序列等);mcrA突变和mcrBC-hsd RMS-mrr deletion 使该菌株更适于克隆甲基化的基因组序列。recA 1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取。lacIqZΔM15标记使得Stbl4菌株可用于蓝、白斑筛选,此菌株具有四环素抗性。BFB生命科学的Stbl4电转感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率可达0.5×1010 cfu/μg DNA,特别适合于慢病毒质粒文库或逆转录质粒文库的构建。
操作方法:
0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
取-80℃保存的Stbl4电转感受态细胞插入冰中5分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。
测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒 pUC19;
对于连接产物,大部分公司的T4连接酶反应体系或50度反应重组体系可与Stbl4电转感受态混合后电击转化,无需进行DNA纯化,但DNA浓度不能过高,DNA浓度不超过100 ng/μl,体积不超过5 μl/50 μl感受态。
对盐浓度较高的DNA溶液或反应体系请用乙醇沉淀DNA后加入适量TE缓冲液 (10 mM Tris HCl, pH7.5; 1 mM EDTA)重悬,然后与Stbl4电转感受态混合进行电击转化。
用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。
启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数,也可按所用电转仪推荐的参数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。
2分钟后从冰中取出电击杯,放室温,加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基(室温),用1ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后,转移到50 ml离心管(BD Falcon 50 ml锥形离心管等),向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。30℃,225 rpm复苏90分钟。当质粒中含有不稳定片段时,30℃培养可降低错误重组的概率,若转化control pUC19计算转化效率,则需37℃,225 rpm复苏60分钟。
5000 rpm离心一分钟收菌,重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的LB平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养17-20小时或30℃培养箱过夜培养20-24小时。若转化control pUC19计算转化效率,则需37℃培养过夜。
若要获得大量,高纯度质粒,建议在TB培养基中30度摇菌培养(以标准质粒PUC19为例:500 ml三角瓶中加入100 ml TB营养液,经30度250 rpm摇菌,可提取约100-200 μg PUC19质粒)。
注意事项:
Stbl4电转感受态只能电击转化,不可用热激方法转化。加入DNA时体积不应大于感受态体积的1/10。
电转感受态细胞加入电击杯应避免产生气泡,气泡会增加弧光放电风险。
当DNA不纯或存在盐,乙醇,蛋白及缓冲液等污染时,转化效率急剧下降。
电击杯里的离子可增加溶液的电导,增大在含有细胞和DNA的溶液中产生电流和弧光放电的风险。
若转化大质粒或想获得较高转化效率,推荐使用高纯质粒提取试剂盒提取质粒。质粒增大一倍,转化效率下降一个数量级。
对于连接产物转化,部分公司的连接体系或重组体系(例如:Thermo,NE
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