商品属性:
产品名称 |
规格 |
保存条件 |
货号 |
ClearColi K12电转感受态细胞 |
5×50 μl/20×50 μl/10 μl |
-80℃(6个月) |
EY-01G98576 |
ClearColi K12电转感受态细胞只能用于电击转化,不能用于热激转化。ClearColi K12菌株来源于K12 endA- recA-菌株。在K12 endA- recA-菌株中引入突变,导致ClearColi K12细胞壁外层的脂多糖(LPS)被修饰:LPS的低聚糖链被删除,同时LPS的两个酰基链也被删除,进而破坏了ClearColi K12大肠杆菌的内毒素信号通路,使得从该细胞中提取的蛋白或质粒DNA中的内毒素含量极低,提取的无内毒素质粒广泛应用于后续的哺乳动物细胞转化。ClearColi K12同时缺失核酸内切酶 (endA)和重组酶 (recA),提高了质粒DNA的产量和质量。BFB生命科学的ClearColi K12电转感受态细胞经特殊工艺制作,pUC19质粒检测转化效率可达1×107 cfu/μg DNA。
操作方法:
0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟,待其沥干水分,正置5分钟,待乙醇挥发干净立即插入冰中,压实冰面,电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖,冰中静置5分钟充分降温。
取-80℃保存的ClearColi K12电转感受态细胞插入冰中5分钟,待其融化,加入目的DNA (质粒或连接产物)并用手拨打EP管底轻轻混匀,避免产生气泡,立即插入冰中。
测定转化效率使用1 μl 10 pg/μl的对照质粒pUC19;
对于连接产物,大部分公司的T4连接酶反应体系或50度反应重组体系可与GT115电转感受态混合后电击转化,无需进行DNA纯化,但DNA浓度不能过高,DNA浓度不超过100 ng/μl,体积不超过5 μl/50 μl感受态。
用200 μl枪头(用刀切除0.5cm枪尖)将感受态-DNA混合物快速移到电击杯中,避免产生气泡,盖上杯盖。
启动电转仪,设置参数:C=25 μF,PC=200 Ω,V=1.8 kV (此为BioRad 电转仪推荐参数,也可按所用电转仪推荐的参数操作),将电击杯快速放入电转槽中,电击完成快速插入冰中。
2分钟后从冰中取出电击杯,放室温,加入700 μl不含抗生素的无菌S.O.C. 培养基(室温),用1 ml 枪吹吸电击杯底部数次混匀后,转移到50 ml离心管(BD Falcon 50 ml锥形离心管等),向离心管中补加S.O.C. 培养基至10 ml。37℃,225 rpm复苏60分钟。
5000 rpm离心一分钟收菌,重悬后取100-200 μl涂布到含相应抗生素的LB(务必使用高盐培养基平板,不可用2YT,SOB,SOC等低盐培养基)平板上(因菌量较大,若全部涂板请选用直径15cm培养皿2-5个)。将平板倒置放于37℃培养箱中培养36-48小时(培养24小时后可看到很小的克隆)。
注意事项:
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