商品属性:
产品名称 |
规格 |
保存条件 |
货号 |
NMY51感受态细胞 |
10×100 μl/50×100 μl/10 μl/5 ml |
-80℃(3个月) |
EY-01G98582 |
DUAL membrane系统是DUAL systems BioTech公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术,它利用分离的泛素系统 (split-ubiquitin)直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用,是目前市面上唯一检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂系统。此系统采用NMY51酵母菌株,可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验;此菌株Transformation marker为:trp1,leu2-3,报告基因为:HIS3,ADE2和 lacZ,第一步通过营养缺陷型报告基因 (HIS3,ADE2)进行选择性生长筛选,进一步通过 LacZ报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选,三个独立的报告基因,受不同启动子的调控,降低假阳性几率。原理:泛素 (ubiquitin)分子量很小,由 76 aa残基组成;泛素作为降解信号分子,可以连接另外一种蛋白质的 N端,然后被泛素专一性蛋白酶 (UBPs)识别,从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。泛素可以人为分成两部分:N端 (Nub),C端 (Cub)。首先,人为地将泛素 Nub的 3位异亮氨酸突变为甘氨酸 (NubI突变为NubG)。这样与 Cub的亲合力大大降低,避免了 Cub和 Nub自我结合或接近的可能性。其次,将Cub部分与人工合成的 LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下 NubG不与Cub 结合,UBPs也不能识别分离的泛素,转录激活因子也不会被切下来。最后,将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合,形成bait融合蛋 (bait-cub-LexA-VP16)和 prey融合蛋白(prey-NubG)。如果bait和 prey发生相互作用,就会促使NubG和Cub的相互接近,被UBPs识别,导致 LexA-VP16的解离,进入核内,从而激活报告基因的转录。 此系统可使用四种Bait质粒:pBT3-N,pBT3-SUC,pBT3-STE,pBT3-C,筛选标志均为LEU;三种Prey质粒:pPR3-C ,pPR3-SUC,pPR3-STE,筛选标志均为TRP。NMY51感受态细胞经特殊工艺制作,-80℃可保存三个月,pGADT7质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。
操作方法:
取100 µl冰上融化的NMY51感受态细胞,依次加入预冷的目的质粒2-5 µg,Carrier DNA (95-100度5min,快速冰浴,重复一次)10 µl,PEG/LiAc 500µl并吸打几次混匀,30度水浴30 min (15 min时翻转6-8次混匀)。
将管放42℃水浴15 min (7.5 min时翻转6-8次混匀)。
5000 rpm离心40 s弃上清,ddH2O 400 µl重悬,离心30 s弃上清。
ddH2O 50 µl重悬,涂平板,29℃培养48-96 h。
注意事项:
地址:上海一研生物科技有限公司
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