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Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。线粒体释放细胞色素c以后，caspase 9可以和细胞色素c以及Apaf1形成复合物，同时被激活。激活的caspase 9可以激活细胞凋亡的最关键酶caspase 3，从而促进后续的细胞凋亡信号。Caspase 9的激活可以通过磷酸化进行调控。
本Caspase 9活性检测试剂盒是基于casepase 8可以催化底物Ac-LEHD-pNA产生黄色的pNA，pNA在405nm 附近有强吸收，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3的活性。
本试剂盒用酶标仪检测或容量不超过100μl的分光光度检测杯检测，可用于培养细胞或新鲜组织样本的caspase-9检测。

储存条件：裂解缓冲液和检测液室温保存；其他-20℃避光保存。
有效期：一年。

注意事项：
● 须自备可以测定 A405或A400的酶标仪或容量不超过100μl的分光光度检测杯及相应分光光度计。优先考虑测定A405。
● 37℃下反应如果颜色变化不明显，可以适当延长反应时间。
● 适合采用 Bradford 法进行蛋白浓度测定。
● 如果样品中蛋白含量低，裂解样品时需设法使样品中的蛋白浓度接近 1-3mg/ml。
● 如果样品中激活的caspase 水平很低，适当调节诱导细胞凋亡的时间，找一个caspase 激活比较强的时间点进行检测。
● Ac-LEHD-pNA 避光保存，使用过程中尽量避光。
● Ac-LEHD-pNA溶液冻存后可能产生沉淀，使用前请混匀。

使用方法：
一、裂解缓冲液和检测缓冲液配制
根据待测样品数准备裂解缓冲液和检测缓冲液，每1ml缓冲液中加入10μl DTT。
二、样品处理
A、细胞样品
1．收集2-5×106个细胞，在4℃，500×g条件下离心2-3分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2．用冷PBS 洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3.在细胞中加入100μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。
4．置冰上15分钟，每隔5分钟高速涡旋振荡15秒。
5.在4℃，500×g条件下离心5分钟。
6．快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
B、组织样品
1．取适量组织样本剪碎，按照50mg/100μl冷的裂解缓冲液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体(或用液氮研磨)，冰上静置15分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
2.在4℃，500×g条件下离心5分钟。
3．快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
三、对上述处理过的上清用Bradford 法进行蛋白定量。
四、Caspase 9活性检测
1．取10μl大约含20-50μg蛋白的裂解上清，加入90μl检测缓冲液。
2．再加入10μl Ac-LEHD-pNA(使用前请混匀)，在37℃下避光反应1-2小时，有黄色颜色产生即可进行检测，如果颜色变化不明显，时间可以延长，甚至孵育
过夜。部分样品中激活的caspase-9 水平较低，颜色变化不明显，直接上机检测，与对照组样品产品变化即可。
3．测定A405nm或A400nm。
4．根据凋亡诱导的细胞的吸光值与空白对照细胞的吸光值的比值计算相对的Caspase 9活性程度。