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本Caspase 3活性检测试剂盒是基于casepase 3可以催化Caspase-3荧光底物产生绿色荧光产物AFC，AFC在400nm激发，发射波长505nm。生成的AFC 量与caspase 3的活性成正比，从而可以通过测定荧光强度来检测caspase 3的活性。
Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 3 也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3或caspase3，属于caspase 家族的CED-3 亚家族(CED-3 subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase 3 是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。Caspase-3在正常状态下以酶原的形式存在于胞浆中，没有活性；但在细胞发生凋亡阶段，Caspase-3被激活，活化的Caspase-3 由两个大亚基和两个小亚基组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。Caspase 3可以剪切procaspase 3、6、7和9，并可以直接特异性剪切许多caspase底物，包括PARP，ICAD，gelsolin和fodrin等。这些由caspase 3 介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。另外，caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，包括染色质固缩，DNA 片段化等。同时caspase 3对细胞起泡也起到关键作用。
本试剂盒可用于培养细胞或新鲜组织样本的caspase-3检测。
我公司还可以提供R110，AMC等荧光标记的Caspase-3活性检测试剂盒。没有荧光检测条件，可以选择我公司的比色法Caspase-3活性检测试剂盒(相关产品HR0424)。

储存条件：裂解液、检测液2-8℃保存；底物、DTT -20℃保存。
有效期：一年。

※ ※ ※ 使用前请仔细阅读产品说明书 ※ ※ ※
使用限制：本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
产品更新：我公司会更新或升级产品，以优化和增强其使用性能，产品说明书会进行相应的版本更新。使用产品时，请参照随产品附带的说明书，不要参照网上下载的说明书，可能是不同的版本。需要最新电子版说明书时可以在收到产品后发邮件索取。
使用安全：使用时需要合适的实验室外套，一次性手套。避免皮肤或粘膜与试剂接触。如果试剂不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。

注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
● 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。

使用方法：

注意事项：
● 变化不明显，可以适当延长反应时间。
● 样品适合采用Bradford法进行蛋白浓度测定。
● 如果样品中蛋白含量低，裂解样品时需设法使样品中的蛋白浓度在10mg/ml以上。
● 如果样品中激活的caspase水平很低，适当调节诱导细胞凋亡的时间，找一个caspase激活比较强的时间点进行检测。
● Caspase-3底物避光保存，使用过程中尽量避光。
● 底物为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
● 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
一、裂解缓冲液和检测缓冲液配制
根据待测样品数准备裂解缓冲液和检测缓冲液，每1ml缓冲液中加入10μl DTT。充分混匀置冰上备用。
二、样品处理
A、细胞样品
1．收集5×106个细胞，在4℃，500×g条件下离心5分钟，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。
2．用冷PBS洗涤细胞两次，每次洗涤后尽可能吸干上清。
3．在细胞中加入50μl冷的裂解缓冲液，高速涡旋振荡15秒。
4．置冰上持续振荡15分钟。
【注】：
● 不同细胞样本需要的时间不一样，如果后续离心有较多沉淀，延长裂解时间，至无明显细胞沉淀为止。
5．在4℃，12000×g条件下离心15分钟。
6．快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上保存备用。
B、组织样品
1．取适量组织样本剪碎，按照每1mg/50μl冷的裂解缓冲液，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体(或用液氮研磨)，冰上静置15分钟，小心将上清吸入另一预冷的干净离心管。
【注】：
●裂解液加组织量的大约3倍体积即可。
2．在4℃，12000×g条件下离心5分钟。
3．快速将上清吸入另一预冷的干净离心管，置于冰上或-80℃冰箱保存备用。
三、对上述处理过的上清用Bradford 法进行蛋白定量。
【注】：
● 必须进行蛋白定量，以保证后续步骤的蛋白上样量足够，否则容易出现检测不到结果的情况。
四、Caspase 3活性检测
1．取50μl裂解上清，加入50μl检测缓冲液。
2．再加入10μl caspase-3荧光底物，充分混匀，在37℃下避光反应1-2小时。
【注】：
● Caspase-3 水平较低时需要延长反应时间。
3．荧光酶标仪检测。Ex=400nm，Em=505nm。
常见问题分析：
趋势不明显，无结果，无法显示与对照组细胞的差异等，其可能的原因主要集中在以下几个方面：
1．样品上样量不够：本方法检测需要的细胞数量须在3×106以上，或者新鲜组织50mg
以上，每次反应的蛋白量需要在100μg以上。如果量不够，请增加细胞或组织的量。
2．样本不新鲜：使用新鲜的细胞或组织样本。
3．样品裂解不够充分：细胞或组织需要进行充分裂解，最好可以加入适当的蛋白酶抑制剂混合物裂解，裂解后应无明显大量的沉淀，以保证有效获得蛋白。
4．样品中激活的caspase-3水平偏低：首先确认模型的凋亡现象是否明显，以及根据文献和其他验证方法确认该凋亡是否激活caspase-3。
5．检测时间点的选择是否合适：不论哪种通路的凋亡，需要在caspase-3被有效激活并达到相应活化程度后的一定时间范围内检测，过早或过晚均不合适。
6．不适合本方法检测：某些凋亡诱导剂诱导的凋亡可能是非依赖于caspase-3活化的机制，此种情况时利用本试剂盒检测caspase-3无明显变化，需要考虑凋亡机制的其他通路。