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Calcein-AM是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM由于在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂(如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate)相比，Calcein-AM是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein的激发和发射波长分别为490nm和515nm。
Calcein,AM仅对活细胞染色。作为核染色染料的PI不能穿过活细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA双螺旋从而产生红色荧光(激发：488,545nm，发射：617nm)，因此PI仅对死细胞染色。

由于Calcein和PI-DNA都可被490nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和死细胞。用545nm激发，仅可观察到死细胞。根据以上特点，Calcein,AM和PI经常被结合用来作为活细胞和死细胞的双重染色。

储存条件：染色液A-20℃避光保存，避免反复冻融，染色液B和试剂C 2-8℃保存，有效期一年。

【注】：
长期不用可以-20℃保存。
染色液Calcein AM注意防潮，避免反复冻融。
染色液A为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否则容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。融解后离心至管底部再打开螺旋盖。
注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。
试剂B溶解后需要用吸头吹打混匀。


注意事项：
本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
避免皮肤或粘膜与试剂接触。


试剂盒以外自备试剂和仪器：
● PBS ● 纯水● 移液器及吸头●离心机●荧光显微镜或激光共聚焦或流式细胞仪

使用注意事项：
螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
染色液A为DMSO溶液，冬季气温低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否则容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。溶解后离心至管底部再打开螺旋盖。
试剂A为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。
细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。
由于Calcein-AM的工作液稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且当天用完。
Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水吸头。
试剂A母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的******工作浓度。
1)用0.1皂素或者0.1-0.5%地高辛孵育细胞10min，或者用70%乙醇孵育细胞30min，从而制备死细胞。
2)用15000倍-1500倍稀释(试剂盒中的母液)的PI溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的******工作浓度。
3)用1000倍-100倍稀释(试剂盒中的母液)的Calcein-AM进行活细胞染色，以得到不会对细胞质染色的******工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。


使用方法：
染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用染料稀释液试剂C将染色液A和B分别10倍稀释。
每10ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入100μl稀释过的染色液A，充分混匀，即成染色工作液A。
每10ml HBSS缓冲液或无血清培养基中加入5-50μl稀释过的染色液B，充分混匀，即成染色工作液B。
【注】
由于不同细胞系的******染色条件不同，初次实验建议做梯度试验，以确定Calcein-AM和PI的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光效果。Calcein-AM染色时间一般15-30分钟，PI染色时间一般1-5分钟。
一般细胞Calcein-AM染色终浓度为试剂盒中母液的1000倍稀释即可，个别细胞可能需要提高浓度至500倍稀释或者延长染色时间。PI的使用终浓度为试剂盒中母液的5000-30000倍稀释，常用10000-20000倍。
Calcein-AM溶液和PI溶液可以分开进行染色，先用Calcein-AM染色，再用PI染色，也可以混合在一起同时染色。最好分开染色。
如果Calcein-AM溶液和PI溶液同时染色时，可以将Calcein-AM溶液和PI溶液根据预实验的终浓度同时加入无血清培养基或HBSS缓冲液中，配成一种染色工作液。注意PI的浓度在染上色的前提下尽可能低，否则可能有细胞毒性，使原本的活细胞上色。
可以不用本试剂盒的染料稀释液，直接用HBSS、无血清培养基配染色工作液。不可以用含血清培养基配制。
Calcein-AM染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
收集样本细胞。
用PBS洗涤细胞两次。
【注】
由于培养箱中的血清等含有脂酶，导致Calcein-AM遇水会分解，导致空白上升，所以需要用PBS洗涤数次直至完全洗净。
贴壁细胞可以原位染色，注意吸除培养基前用培养板离心机离心，防止丢掉漂浮的死细胞。PBS洗涤时也需要离心培养板。
用200μl染色工作液将细胞重悬。
【注】
Calcein-AM溶液和PI溶液可以分开进行染色，先用Calcein-AM染色，再用PI染色，也可以混合在一起同时染色。最好分开染色。
有时候可添加一定量的非离子表面活性剂如Pluronic F127到Calcein-AM内来增强其水溶性。制备染色工作液前，取一管需要用的Calcein-AM内加入20% Pluronic F127，使Pluronic F127的终浓度为0.02%。
含Pluronic F127的Calcein-AM溶液不可长期保存，现配现用。
在室温或37℃避光孵育15-30分钟。
【注】
如果分开染色，Calcein-AM染色15-30分钟，PI染色1-5分钟即可。
同时染色时，一定要注意PI浓度，防止染色活细胞。
如果细胞本身含有有机阴离子转运体，需加入丙磺舒(Probenecid，1-2.5mM)或者苯磺唑酮(Sμlfinpyrazone，0.1-0.25mM)到孵育体系内以降低染料Calcein泄露到胞外。
用PBS洗涤细胞。
【注】
如有必要，使用含有阴离子转运抑制剂的缓冲液来进行细胞清洗。
用适量PBS重悬细胞。
用流式细胞仪或荧光显微镜检测结果。******激发为490nm，******发射波长分别为515nm和617nm。
【注】
在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基再次清洗掉细胞外的染料后再观察。


结果分析：
荧光显微镜下，使用488nm波长激发，活细胞为黄绿色，死细胞为红色。
用545nm波长激发，仅能够看到红色的死细胞。