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Calcein-AM 是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，Calcein-AM 由于在Calcein的基础上加强了疏水性，因此能够轻易穿透活细胞膜。当其进入到细胞质后，酯酶会将其水解为Calcein 留在细胞内，发出强绿色荧光。与其它同类试剂(如BCECF-AM和Carboxy-fluorescein diacetate)相比，Calcein-AM 是最适合作为荧光探针去染活细胞的，因为它的细胞毒性很低。Calcein的激发和发射波长分别为490 nm和515 nm。Calcein -AM仅对活细胞染色。
7-AAD 是一种非渗透性荧光染料，作为核染色染料的7-AAD 不能穿过正常活细胞的细胞膜，但可穿透膜损伤细胞如晚期凋亡细胞或者坏死细胞的细胞膜，它穿过死细胞膜的无序区域而到达细胞核，并嵌入细胞的DNA 上，形成具有高荧光性的加成物，从而产生红色荧光(激发：488，545nm，发射：647 nm)，因此7-AAD仅对膜损伤的死细胞染色。可以用来检测膜损伤的无活性的细胞。
由于Calcein和7-AAD-DNA都可被490 nm激发，因此可用荧光显微镜同时观察活细胞和膜损伤细胞。用545 nm 激发，仅可观察到膜损伤细胞。

储存条件：染料-20℃避光保存；避免反复冻融；稀释液2-8℃保存。
有效期：六个月。

※ ※ ※ 使用前请仔细阅读产品说明书 ※ ※ ※
使用限制：本试剂盒仅供科学研究使用，不可用于诊断或治疗。
产品更新：我公司会更新或升级产品，以优化和增强其使用性能，产品说明书会进行相应的版本更新。使用产品时，请参照随产品附带的说明书，不要参照网上下载的说明书，可能是不同的版本。需要最新电子版说明书时可以在收到产品后发邮件索取。
使用安全：使用时需要合适的实验室外套，一次性手套。避免皮肤或粘膜与试剂接触。如果试剂不小心接触皮肤或眼睛，应立即用水冲洗。

注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖和管内壁上的液体离心至管底，避免开盖时试剂损失。
● 禁止与其他品牌的试剂混用，否则会影响使用效果。
● 样品或试剂被细菌或真菌污染或试剂交叉污染可能会导致错误的结果。
● 最好使用一次性吸头、管、瓶或玻璃器皿，可重复使用的玻璃器皿必须在使用前清洗并彻底清除残留清洁剂。
● 实验后完成后所有样品及接触过的器皿应按照规定程序处理。
试剂盒以外自备仪器和试剂耗材：
仪器
●离心机 ●荧光显微镜/流式细胞仪 ● 移液器 ●冰箱 ●冰盒
耗材
●离心管 ● 吸头
试剂
● PBS、HBSS

使用方法：

使用注意事项：
● 螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
● 细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
● 由于Calcein-AM的稳定性比较差，染色工作液必须现配现用，并且在当天用完。
● Calcein-AM对湿度非常敏感，若是Calcein-AM溶液每次取完需要量后，必须紧紧密封盖子。建议根据单次用量，分装密封保存。不可使用含水的吸头。
●试剂A 母液请拧紧螺旋盖，避免受潮失效。
●染色液A 为DMSO溶液，冬季气温较低时在室温时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热溶解，吸头也需要放在培养箱预热，否者容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。
●试剂量较少，为了便于观察防止误操作导致损失，在试剂盒中时是采用透明管包装，收到后可以离心移入干燥黑色避光密封管或者用铝箔包裹避光。

使用方法：
1．染色工作液的配制：
根据样品数按下列比例配制染色工作液。
用稀释液将染料10倍稀释，再用相应的无血清培养基或其他缓冲液(如HBSS)进行50-100倍稀释，配制成染色工作液。。
【注】：
● 由于不同细胞系的******染色条件不同，初次实验建议做梯度实验，以确定 Calcein-AM和7-AAD的最适浓度。梯度筛选的原则为使用最低的探针浓度得到最好的荧光结果。
● 一般细胞按以上稀释比例1000倍稀释即可，个别细胞可能需要提高浓度至200-500倍稀释或者延长染色时间。
● Calcein-AM溶液和7-AAD溶液可以混合在一起染色，也可以分开进行染色，先染色Calcein AM，再染色7-AAD。
2．收集样本细胞，细胞数量在1×106个以内。
3．用PBS 洗涤细胞两次。
【注】：
● 由于培养基中的血清等含有酯酶，导致Calcein-AM 遇水会分解，会导致空白上升，所以需要用PBS 洗涤数次直到完全洗净。
4．用200μl染色工作液将细胞重悬。
5．4℃避光孵育15-30分钟。
6．用PBS洗涤细胞。
7．用适量PBS重悬细胞。
8．用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。染料-DNA 复合物的******激发490±10nm，******发射波长分别为515nm和647nm。
【注】：在荧光显微镜下观察时，如果背景高，可以用培养基再次清洗掉细胞外的染料后再观察。

结果分析：
荧光显微镜下，使用490±10nm波长激发，活细胞为黄绿色，膜损伤细胞为红色。
用545 nm波长激发，能够看到红色的膜损伤细胞/死细胞。